全面了解荧光光谱（荧光发射光谱图分析）

1.荧光的定义荧光有一些定义和解释：a .“荧光是物质或分子发出的发光”。所谓冷光，是指光不是由热产生的，而是可以由光、电、化学反应等诱发的(反正不可能是热引起的)。b .“常温物质受到一定波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射时，吸收光能后进入激发态，立即去激发，发出波长比入射光波更长的出射光(通常在可见光波段)；而且，一旦入射光停止，发光现象立即消失。具有这种性质的发射光称为荧光。”

这些词的解释很难理解和形象化。事实上，对荧光最好的解释来自于对光子与物质分子相互作用过程(分子的激发和弛豫)的理解。

2.荧光从何而来？——分子的激发和弛豫？图1

PS:图1摘自Joseph R. Lakowicz的《荧光光谱学原理》。

图1是一个Jablonski图(简单理解为能级图)。在图S0中，S1和S2分别示出了电子的基态、分子中电子的第一和第二激发态。当分子吸收光子时，电子可能从基态(S0)跃迁到激发态(S1，S2)。当激发态不稳定时，电子会从激发态(S1，S2)回到基态(S0)并发出荧光(这是荧光的来源)。当然，它不一定要发出荧光，但它可以产生热量或其他形式的能量。如果电子通过系统间的沟道效应从激发态(S1)转换到电子T1的激发态，然后从激发态T1回到S0，就发出磷光。磷光和荧光的根本区别就在这里。S1激发态和T1激发态的区别主要在于电子自旋的方向(单重态和三重态)。

分子吸收光后，其中电子的激发和弛豫需要分别满足两个定律。激发过程满足弗兰克-康登规则；毁容满足卡沙法则。弗兰克-康登规则(图2A)的大意是，电子的跃迁过程非常快，在这个过程中原子核的相对位置来不及改变，可以简单理解为垂直跃迁。卡沙法则(图2B)规定，在电子弛豫和复合的过程中，电子必须先弛豫到激发态的最低能级，然后再回到基态。如图2所示：

图2

PS:图2摘自维基百科相关词条。

3.如何解读荧光光谱(稳态)3a:荧光光谱分为激发光谱(PLE)和发射光谱(PL)。

激发光谱：固定发射光的波长，改变激发光的波长，记录荧光强度随激发波长的变化。

发射光谱：激发光波长固定，记录不同发射波长下荧光强度随发射波长的变化。

无论是激发还是发射荧光谱图，都记录了发射荧光强度随波长的变化。所以在荧光光谱中，纵坐标是强度，横坐标是波长。首先，从图中可以得到峰位和半峰宽。峰的直观体现是荧光的颜色；峰的半宽度表示荧光的纯度。

图3

PS:图3摘自Nano Letters，21027。

荧光光谱往往与吸收光谱同时出现。所以可以和分子的吸收光谱做比较。图3A显示了同一物质的吸收光谱(UV-Vis)、荧光激发光谱(PLE)和荧光发射光谱(PL)。不难发现，激发光谱与吸收光谱非常相似。但它们本质上是不同的。吸收光谱的纵坐标是吸光度，反应物质吸收光。荧光光谱的纵坐标是分子发出荧光的强度，它不仅与物质的光吸收能力有关，还与量子效率有关。在许多研究系统中，经常通过组合来分析问题

为什么会发生斯托克斯位移：如图1所示，处于激发态(如S1)的电子并不直接辐射到基态(S0)，而是先发生振动弛豫和内转换。所有这些过程都会消耗一些能量。同时跃迁到基态的电子也需要一系列的振动弛豫。这些原因导致能量损失，这反映在光谱的红移。

图4

PS:图4摘自Joseph R. Lakowicz的《荧光光谱学原理》。

发现荧光发射光谱的形状与激发波长无关，但与吸收光谱保持一定的镜像对称，如图4所示。前者是因为卡沙的统治。电子无论被激发到哪个激发态，都会先弛豫到S1，然后辐射到基态发出荧光，所以发射光谱与激发波长无关。后者是对称的，因为电子的基态与电子的第一激发单重态的振动能级相似，振动跃迁几率也相似。请参见下面的图5。

图5

PS:图5摘自Joseph R. Lakowicz的《荧光光谱学原理》。

仔细观察发现，图4中横坐标的刻度并不均匀，因为分子的吸光度和相对光子通量与波长的比值不同(详见《荧光分析法》)。

4.量子效率量子效率和荧光寿命是荧光光谱中非常重要的信息。量子效率定义为荧光物质发射的光子数与吸收的光子数之比。注意量子效率和荧光强度的区别。物质的高量子产率并不意味着它的荧光强度就一定高。荧光强度不仅与量子效率有关，还与物质的吸光度有关。测量量子效率有两种方法：绝对法和相对法。

绝对法则：

绝对量子效率不需要用标准物质做参考，测量误差比较小。如图6所示。首先，选择波长合适的稳定单色LED作为光源(一般发射波长为400—450 nm)作为激发光源。用溶剂将待测样品逐步稀释成一系列不同浓度的溶液。当稀释溶液达到平衡和稳定时，测量绝对荧光效率。打开激发光源，将小瓶中的空白溶液和一系列配制好的待测溶液分别放入光学积分球中。此时，吸收的激发光子和发射的荧光光子在光学积分球中经过一系列的反射和吸收，最终通过光纤传入QE65000光谱仪系统。记录吸收的激发光子数和发射的荧光光子数，然后根据定义计算绝对量子效率。

图6

PS:图6和绝对方法描述摘自浙大博士论文《核壳量子点激子态的合成控制》。

相对方法：

在相同的激发条件下，通过比较被测物质与已知量子效率物质的积分荧光强度，计算被测物质的量子效率。计算公式如下：

PS:公式来自《荧光分析法》。

其中：Y1、Y2分别代表对照物质和受试物质的量子产率；F1、F2是参考物质和测试物质的积分荧光强度；A1、A2是参考物质和测试物质的吸光度。