2020-08-24质粒构建 异硫氰酸胍的作用

网上有很多关于2020-08-24质粒构建的问题，也有很多人解答有关异硫氰酸胍的作用的知识，今天艾巴小编为大家整理了关于这方面的知识，让我们一起来看下吧!

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一、2020-08-24质粒构建

一、2020-08-24质粒构建

获取一个基因CDS序列的方法如下：打开https://www.ncbi.nlm.nih.gov，如下图所示，依次在1处选择核苷酸，2处输入“PDCD1”，3处点击搜索，结果出来后再在4处点击“智人”进一步筛选(如果想做鼠源，选择Musculus，选择其他物种)。

那么第一项就是我们需要的序列信息。单击它并向下拉，直到您看到光盘(如下所示)。点击CDS，会出现如下所示的内容。序列中有背景色的部分就是我们需要的序列。可以看出，该序列的开始是ATG起始密码子，最后三个是TGA终止密码子。选择要复制的序列。

因为需要对整个CDS区进行PCR，所以正向和反向引物的选择余地不大，根据上述原理，甚至可以简单粗暴地从正向和反向选择约22个碱基作为引物，例如：

正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外需要注意的是，引物等序列的书写方向是5’到3’，一般不是3’到5’，所以我们的CDS虽然没有标明方向，但实际上是5’到3’。虽然你可以这么简单粗暴的设计引物，但我还是想教你用Primer Premier 5，一个经典的引物设计软件。如下所示使用底漆5。首先，单击文件-新建-DNA序列。

然后在空白处点击Ctrl V粘贴我们的CDS序列，按原样选择，也就是我们复制什么样的序列就粘贴什么样的序列。下面依次是“逆序列粘贴”、“互补序列粘贴”、“逆互补序列粘贴”。点击左上角的引物，如下图，S=正义，A=反义。

如果对当前的引物不满意，还可以点击编辑引物来编辑序列，如下所示。我们删除最后三个碱基，然后我们需要先点击分析，然后点击确定。我们可以看到正向引物从25个碱基变成了22个碱基。

最后点击编辑-复制-正义引物，粘贴到Word中，得到正向引物。反向引物被复制后，会自动变成5’到3’的序列。所以很方便。这样，我们初步设计了用于PCR的PDCD1的正向和反向引物。如果你只是想p出基因PDCD1，目前的引物可以送去合成，但是如果你想把它构建成载体，那么我们就需要进一步加工。底漆5的使用

根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达(pcDNA 3.0)、敲除(pLKO.1-TRC)、原核纯化(pGEX-4T1、pET-28a)、病毒包装(pMSCV-puro)、敲除(lentiCRISPR v2)等。我们以过表达载体pcDNA 3.0为例来说明一下。

从质粒图谱中我们可以看到多个克隆位点有多个限制性位点可以选择，那么每个位点都可以用吗？当然不是！我们应该选择那些PDCD1(或者其他靶基因)没有的限制性位点！所以我们也需要用引物5来分析PDCD1没有的东西。

或者打开引物5，然后粘贴CDS序列，点击酶，2所有酶。我们对比质粒图谱选择有多个克隆位点的酶，双击转到3的框，选择后点击确定，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不能选，其他的可以选。

不过一般还是选择那些常用的，好用的，实验室现成的酶比较好。例如，如果我们选择EcoRI和XhoI，那么我们可以在引物上添加相应的限制性位点。于是我们得到了以下引物：好了，现在可以把这些引物送到相应的公司合成了。质粒构建终于到点了！

在合成引物后，我们用ddH2O作为母液将其稀释至100微米，并取一些稀释至10微米用于下一个实验。首先，我们p出目标基因。在这一步，我们建议使用高保真PCR酶。我一般用东洋纺公司的KOD-PLUS-Neo酶。反应体系和反应条件如下：获得模板。

PCR后运行1%的凝胶回收目的片段，或者直接用PCR Clean kit回收。回收后需要双酶消化，同时需要酶消化适量的载体。如果使用Fermentas(热)酶，也可以打开http://t.cn/RVuwBVo网站查询双酶消化的最佳缓冲液。通过酶消化连接回收的片段。我用的是赛默飞公司的T4连接酶，系统如下：

现在T4连接酶基本上是快速酶。比如赛默飞宣称10分钟就能完成连接，但我保险起见，一般30分钟连接，不要通宵连接！连接完成后就是转化，选菌(单克隆)，摇菌提取质粒，送测序就OK了！TRIzol法提取RNA

TRIzol法是一种成熟的RNA提取方法。Invitrogen的TRIzol比较稳定，应用广泛。当然，部分国产TRIzol产品也能满足大部分情况下RNA提取的需要。注意事项和原则

注1、 RNase非常稳定，是导致RNA降解的最主要物质。在某些极端条件下可暂时失活，但去除限制性因素后会迅速复性。常规高温高压蒸汽灭菌和蛋白抑制剂不能完全灭活RNase。它广泛存在于人体皮肤中，因此在与RNA制备相关的分子生物学实验中必须戴手套。

RNase污染的另一个来源是液体提取器。通常，用DEPC制备的70%乙醇用于擦洗液体提取器的内部和外部。使用特殊的无RNA酶枪头和离心管提取RNA。

2、TRIzol试剂有剧毒。如果接触到皮肤，立即用大量洗涤剂和水清洗！

溶液配方及原理1、TRIzol试剂：TRIzol可以破碎细胞，溶解细胞内容物，同时保持RNA的完整性。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，释放细胞内的蛋白质和核酸。异硫氰酸胍是一种强力的蛋白质变性剂，能溶解蛋白质，使蛋白质的二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白与核酸快速分离。

2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。

3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。

4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。

操作步骤

1、细胞破碎

A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。 B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。 C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。

加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。

如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2~8，12000g离心10 min去除这些物质。

关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量： 一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500L~1 mL/6 cm Dish、200~500 L/3.5 cm Dish（仅供参考）

2、氯仿抽提分层 加入TRIzol后，室温（15~30）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000g，2 8离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。

RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。

3、用异丙醇使RNA沉淀 将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。

加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000g，2~8离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。

4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐 去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500g 2~8离心5 min。

5、用DEPC水溶解RNA 去除上清后，将管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。 逆转录法合成cDNA

一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。

Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。

Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。

两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。

操作步骤

步骤简述如下：按照下图中1配制溶液，然后65处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。

连接产物的转化

常用的感受态细胞有DH5、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。

注意事项

1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高； 2. 避免反复冻融感受态细胞； 3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸； 4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。

操作步骤

1. 取50 L感受态细胞置于冰上融化；

2. 加入5 L连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42）；

3. 42水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 min；

4. 加入500 L无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏；

5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 L左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37 倒置培养 16 18h；质粒：直接取20 50 L涂于LB培养板上培养即可。

质粒的小量提取

ABOUT 质粒抽提

实验原理：

较常用的质粒提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（15kb）。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为：当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会再次形成。

在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。

当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。

实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》 ）

1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100g/ml RNase A

原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。

2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS

原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。

3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸

原理：这一步的K+置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。

操作步骤

1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20，也可直接将菌液保存于4（短时间）。 注意：如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。

2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500l的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。 注意：若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。

3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500l溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。

注意：菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4、向离心管中加入500l溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。 注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。

此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5、向离心管中加入700l溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。 注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800l）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。 如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5，TOP10等），这步省略。

8、向吸附柱中加入600l漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。

9、重复操作步骤8。

10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300l洗脱缓冲液EB（65预热），室温放置或65水浴2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中重复步骤

11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100l，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ，以防DNA 降解。

结果判断 1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定 （1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50g/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

另外，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。

（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2l所提质粒+48l ddH2O，则blank为2l洗脱液+48l ddH2O）。

2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测 （1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。

（2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，因此会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。

测序结果的分析

构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。

可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。

测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下：

在公众号内回复“ 通用测序引物”获取此Excel！

测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。

一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。

1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列：

2. 然后点击File-New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl+A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。

3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File-Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence-Multiple Sequence Alignment；

4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可：

5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands：

6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。

1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File-Blast Search:

以上就是关于2020-08-24质粒构建的知识，后面我们会继续为大家整理关于异硫氰酸胍的作用的知识，希望能够帮助到大家！