dpph抗氧化实验步骤？ dpph自由基清除率

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内容导航：

一、dpph抗氧化实验步骤？

二、DPPH自由基清除率如何确定加入多少样品和DPPH溶液

三、乙酰化离心没有上清液

四、DPPH自由基清除实验，为什么会达到最大清除率

一、dpph抗氧化实验步骤？

方法/步骤

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DPPH自由基清除能力的测定

称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04毫克/毫升的DPPH溶液。取2mL不同浓度(2，4，6，8mg/ml)的溶液，加入2mL DPPH溶液，混匀，室温放置30min，以5000r/min离心10min。取上清液，在517nm处测量吸光度。Vc作为阳性对照。样品的DPPH自由基清除率通过以下公式计算：

A0-2ml无水乙醇2mL DPPH溶液吸收值；A1—2mL样品溶液，2mL DPPH溶液；a2—2mL样品溶液中2mL无水乙醇的吸光度。

亚铁离子螯合能力的测定

取1mL不同浓度(2，4，6，8 mg/ml)的溶液和3.7mL蒸馏水，加入0.1ml 2 mmol/L的FeCl2溶液和0.2ml 5 mmol/L的吩嗪溶液，25水浴10min，在562nm处测量吸光度。EDTA是阳性对照。计算样品对Fe2螯合率的公式如下：

A0-1 ml蒸馏水代替反应体系中的样品溶液；

A1—反应后样品溶液的吸光度；

A2-0.1ml蒸馏水代替反应体系中的O。

二、DPPH自由基清除率如何确定加入多少样品和DPPH溶液

DPPH清除率是一个相对值。如果浓度大，超过1，就需要稀释，稀释次数要均匀。如果稀释50倍，可以稍后用稀释后的溶液进行检测，不经换算直接处理结果，但要注明稀释倍数。

三、乙酰化离心没有上清液

无上清液乙酰化离心：通过乙酰化获得的新型抗肿瘤化合物。制备方法如下：(1)取干燥黑灵芝100克，室温下用95%乙醇浸泡提取48小时，过滤一次，将残渣室温下在通风处风干，然后将残渣与蒸馏水按质量体积比(kg/L)1:20混合，回流提取两次，每次提取时间为2小时。向所得样品中加入适量的95%乙醇，使溶液中乙醇的体积分数为80%，然后沉淀，4静置24小时，离心过滤；合并沉淀物，依次用无水乙醇、无水乙醚和丙酮洗涤，冷冻干燥得到样品；得到的干样品用Sevag法去除蛋白质，即将Sevag试剂(体积比氯仿：正丁醇=5: 1)和干样品以1: 1的质量比混合均匀，然后静置去除下层蛋白质变性层；浓缩样品并重复10次去蛋白操作；将脱蛋白样品浓缩，用95%乙醇洗涤，浓缩，冷冻干燥，得到粗提样品；将粗提物样品用透析袋透析3天，将袋中的样品浓缩至小体积，冷冻干燥得到灵芝精提物；(2)取500毫克上述得到的黑灵芝提取物，加入蒸馏水配制成浓度为3-5毫克/毫升的溶液，离心，取上清液用Purifier 100生物大分子纯化系统和凝胶柱hil oad 26/60 super dex-200 pre grade进行凝胶柱层析。加载样品前，样品和洗脱液通过0.22m微孔滤膜以保护分离柱。洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，部分收集体积为8mL/管。通过紫外检测器和示差折光检测器(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱。将6-14管混合，浓缩，冷冻干燥，得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色絮状固体；(3)AC-PSG的制备：称取0.3g冻干PSG于反应管中，加入10mL蒸馏水，混匀，加入0.5mol/L NaOH调节pH值至9.0，30保温4h。在此期间，在搅拌的同时，将一定量的乙酸酐分六次加入到溶液中，同时，连续滴加0.5mol/L NaOH以保持pH值为8.0。反应后，用5mol/L HCl调节溶液的pH值至7.0，将混合溶液置于透析袋中用蒸馏水透析三天(透析袋的相对分子量为8 000 ~ 12 000)，加入4倍量的无水乙醇反复沉淀透析袋中的溶液。本发明的乙酰化产物Ac-PSG能刺激巨噬细胞，明显增强巨噬细胞的吞噬能力和细胞上清液中TNF-的蛋白表达，从而增强机体的免疫功能，从而增强抗病能力，具有很强的还原力，能中和更多的亚油酸自由基和体系中形成的其他自由基，减缓-胡萝卜素的消退，可用于抗肿瘤。图1是Ac-PSG1的高效凝胶渗透色谱图。图2显示了PSG和Ac-PSG3的红外光谱。图3是PSG、Ac-PSG1和Ac-PSG 2的DPPH自由基清除能力的示意图。图4是PSG、Ac-PSG1和Ac-PSG 2抑制-胡萝卜素-亚油酸体系氧化的能力示意图。

实施例1:乙酰化得到的新型抗肿瘤化合物，通过以下步骤制备：(1)取干燥的黑灵芝100克，室温下用95%乙醇浸泡提取48小时，过滤，重复一次，将残渣室温下通风处干燥，然后将残渣与蒸馏水按质量体积比(kg/L)120混合，回流提取两次，每次依次提取2小时。向所得样品中加入适量的95%乙醇，使溶液中乙醇的体积分数为80%，然后沉淀，4静置24小时，离心过滤；合并沉淀物，依次用无水乙醇、无水乙醚和丙酮洗涤，冷冻干燥得到样品；得到的干样品用Sevag法去除蛋白质，即将Sevag试剂(体积比氯仿：正丁醇=5: 1)和干样品以1: 1的质量比混合均匀，然后静置去除下层蛋白质变性层；浓缩样品并重复10次去蛋白操作；将脱蛋白样品浓缩，用95%乙醇洗涤，浓缩，冷冻干燥，得到粗提样品；将粗提物样品用透析袋透析3天，将袋中的样品浓缩至小体积，冷冻干燥得到灵芝精提物；(2)取500毫克上述得到的黑灵芝提取物，加入蒸馏水配制成浓度为3-5毫克/毫升的溶液，离心，取上清液用Purifier 100生物大分子纯化系统和凝胶柱hil oad 26/60 super dex-200 pre grade进行凝胶柱层析。加载样品前，样品和洗脱液通过0.22m微孔滤膜以保护分离柱。洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，部分收集体积为8mL/管。通过紫外检测器和示差折光检测器(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱。将6-14管混合，浓缩，冷冻干燥，得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色絮状固体；(3)AC-PSG的制备：称取0.3g冻干PSG于反应管中，加入10mL蒸馏水，混匀，加入0.5mol/L NaOH调节pH值至9.0，30保温4h。在此期间，在搅拌下分六次向溶液中加入1mL乙酸酐，并连续滴加0.5mol/L NaOH以保持pH值为8.0。反应后，用5mol/L HCl将溶液的pH值调节至7.0，将混合溶液用蒸馏水透析3天(透析袋的相对分子量为8 000 ~ 12 000)。通过加入4倍的无水乙醇反复沉淀透析袋中的溶液。

实施例2:乙酰化得到的一种新型抗肿瘤化合物，制备方法如下：(1)取100g干燥黑灵芝，室温下用95%乙醇浸泡提取48小时，过滤一次，室温下将残渣在通风处风干，然后将残渣与蒸馏水按质量体积比(kg/L)1:20混合，回流提取两次，每次2小时。向所得样品中加入适量的95%乙醇，使溶液中乙醇的体积分数为80%，然后沉淀，4静置24小时，离心过滤；合并沉淀物，依次用无水乙醇、无水乙醚和丙酮洗涤，冷冻干燥得到样品；得到的干样品用Sevag法去除蛋白质，即将Sevag试剂(体积比氯仿：正丁醇=5: 1)和干样品以1: 1的质量比混合均匀，然后静置去除下层蛋白质变性层；浓缩样品并重复10次去蛋白操作；将脱蛋白样品浓缩，用95%乙醇洗涤，浓缩，冷冻干燥，得到粗提样品；将粗提物样品用透析袋透析3天，将袋中的样品浓缩至小体积，冷冻干燥得到灵芝精提物；(2)取500毫克上述得到的黑灵芝提取物，加入蒸馏水配制成浓度为3-5毫克/毫升的溶液，离心，取上清液用Purifier 100生物大分子纯化系统和凝胶柱hil oad 26/60 super dex-200 pre grade进行凝胶柱层析。加载样品前，样品和洗脱液通过0.22m微孔滤膜以保护分离柱。洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，部分收集体积为8mL/管。通过紫外检测器和示差折光检测器(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱。将6-14管混合，浓缩，冷冻干燥，得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色絮状固体；(3)AC-PSG的制备：称取0.3g冻干PSG于反应管中，加入10mL蒸馏水，混匀，加入0.5mol/L NaOH调节pH值至9.0，30保温4h。在此期间，在搅拌下分6次向溶液中加入3mL乙酸酐，并连续滴加0.5mol/L NaOH以保持pH值为8.0。反应后，用5mol/L HCl调节溶液的pH值至7.0，将混合溶液置于透析袋中用蒸馏水透析3天(透析袋的相对分子量为8 000 ~ 12 000)，加入4倍量的无水乙醇反复沉淀透析袋中的液体。

实施例3:乙酰化得到的一种新型抗肿瘤化合物，制备方法如下：(1)取100g干黑灵芝，室温下用95%乙醇浸泡提取48小时，过滤一次，室温下将残渣在通风处风干，然后将残渣与蒸馏水按质量体积比(kg/L)1:20混合，回流提取两次，每次提取2小时。向所得样品中加入适量的95%乙醇，使溶液中乙醇的体积分数为80%，然后沉淀，4静置24小时，离心过滤；合并沉淀物，依次用无水乙醇、无水乙醚和丙酮洗涤，冷冻干燥得到样品；得到的干样品用Sevag法去除蛋白质，即将Sevag试剂(体积比氯仿：正丁醇=5: 1)和干样品以1: 1的质量比混合均匀，然后静置去除下层蛋白质变性层；浓缩样品并重复10次去蛋白操作；将脱蛋白样品浓缩，用95%乙醇洗涤，浓缩，冷冻干燥，得到粗提样品；将粗提物样品用透析袋透析3天，将袋中的样品浓缩至小体积，冷冻干燥得到灵芝精提物；(2)取500毫克上述得到的黑灵芝提取物，加入蒸馏水配制成浓度为3-5毫克/毫升的溶液，离心，取上清液用Purifier 100生物大分子纯化系统和凝胶柱hil oad 26/60 super dex-200 pre grade进行凝胶柱层析。加载样品前，样品和洗脱液通过0.22m微孔滤膜以保护分离柱。洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，部分收集体积为8mL/管。通过紫外检测器和示差折光检测器(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱。将6-14管混合，浓缩，冷冻干燥，得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色絮状固体；(3)AC-PSG的制备：称取0.3g冻干PSG于反应管中，加入10mL蒸馏水，混匀，加入0.5mol/L NaOH调节pH值至9.0，30保温4h。在此期间，在搅拌下分六次向溶液中加入5mL乙酸酐，同时连续滴加0.5ml/L NaOH以保持pH值为8.0。反应后，用5ml/L HCl将溶液的pH值调节至7.0，将混合溶液用蒸馏水透析3天(透析袋截留的分子量为8 000 ~ 12 000)。通过加入4倍的无水乙醇反复沉淀透析袋中的溶液。产物的物理和化学性质通过红外光谱分析实施例1-3中制备的Ac-PSG，并确定乙酰化程度。同时测定了纯度、平均分子量和糖醛酸含量。(1)纯度鉴定通过高效渗透凝胶色谱法检测纯度。取3mg供试品溶于1mL蒸馏水中，以1000rpm离心10min，用微孔滤膜过滤，然后自动上样20L，记录洗脱曲线，确定组分纯度。实验中使用的高效液相色谱的具体测试条件为：(1)色谱柱为ultrahydrogeltm 500 300mm7.8 mmid；流动相为0.1MNaCl；流速为0.6毫升/分钟；柱温为35。(2)分子量测定的液相色谱柱为Ultrahydralogtm 500 300mm7.8 mmid，流动相为0.1MNaCl，流速为0.6mL/min，柱温为35。配制标准品Glc、T10、T40、T70、T500和T2000的2%溶液，HPLC进样后得到相应的液相色谱图。设T2000的洗脱体积为柱空体积V0，Glc的洗脱体积为柱总体积Vt，用公式kav=(ve-v0)/(vt-v0)计算，用LogMw-Kav绘制标准曲线。根据样品的Ve，可以从标准曲线中得到样品的分子量。因为洗脱液的流速是恒定的，所以可以画出保留时间与分子量关系的标准曲线，根据其回归方程可以得到各产物的分子量。(3)糖醛酸含量的测定a .采用改进的硫酸咔唑法，以半乳糖醛酸为指示剂测定糖醛酸含量

绘制标准曲线，准确称取半乳糖醛酸对照品适量，加超纯水溶解，摇匀，制成0.16432、0.32864、0.49296、0.65728、0.8216、0.98592、1.15024、1.31456、1.47888mg/mL系列标准溶液。根据上述色谱条件，分别进样20L，测定半乳糖醛酸的峰面积。以半乳糖醛酸的峰面积为横坐标，对照品浓度(mg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线。得到回归方程。样品中糖醛酸含量的测定：分别称取一定量的样品，加入超纯水溶解并定容至10mL，制成样品溶液。根据制作标准曲线时的色谱条件，用回归方程计算出样品中糖醛酸的含量。(4)红外光谱分析：取1-2毫克样品，用KBr压片法进行常规红外光谱分析。红外光谱仪测定的参数为：背景扫描次数：128次；分辨率：4.0cm-1；探测器：DTGS。(5)乙酰化度的测定将10 mg乙酰化Ac-PSG样品置于指状试管中，将试管和样品置于五氧化二磷干燥器中，在80下干燥8小时。向试管中加入0.5ml 2.0mol/L HCl-无水甲醇溶液，在乙醇-干冰槽中冷却试管，用氧气炬密封，在100下保温4h进行甲醇分解。冷却后，打开试管，小心地将试管连同内容物一起放入蒸馏室，在4000Pa-5330Pa的真空下蒸馏，保持蒸馏室的温度在35-45。当所有酸性甲醇蒸馏完毕后，在试管中加入无水甲醇，然后蒸馏，将两种蒸馏液收集合并在一个试管中进行比色测定。将装有蒸馏水的试管在20-25的水浴中保持1-2分钟，加入1mL水，然后加入2ml 0.75mol/L高氯酸溶液，再加入1mL高氯酸铁溶液。5分钟后，在520纳米波长处测量吸光度。标准溶液为溶解在2mL甲醇-水(l:l，v/v)中的1-10mol乙酸甲酯，空白溶液为HCL-甲醇溶液。Ac-PSG的改性程度用Ac-PSG中乙酰基的含量(AC%)或取代度(DS)来表示：DS=1.62 AC%/(43-0.42 AC%)。从表1可以看出，随着乙酰化试剂用量的增加，乙酰基的取代度从0.77开始逐渐增加。此外，乙酰化剂的用量对Ac-PSG的分子量有很大影响。随着乙酰化程度的加深，Ac-PSG的分子量逐渐下降，当乙酰化程度达到高取代度时，Ac-PSG的平均分子量下降到原来的五分之一。可能是乙酰化过程中一些糖苷键断裂了。在红外光谱图2中，可以清楚地看到乙酰化PSG在1735 cm-1-1750 cm-1 ( c=O)和1200cm-1-1230cm-1(c-o)处有比PSG更强的吸收峰，这是乙酸酐与PSG中羟基反应生成羧酸酯的吸收峰，证明了乙酰基。最明显的是乙酰化的PSG在1365cm-1-1380cm-1(sch 3)有一个吸收峰，而PSG由于不含甲基，所以没有这个吸收峰。修饰程度越高，该峰的面积越大。3600-3100cm-1处的伸缩振动吸收峰为-O-H，出现在上图中，说明乙酰基没有取代全部羟基。二、 1的功能活性研究。体外免疫活性实验(1)巨噬细胞的分离和纯化通过使两只小鼠的颈椎脱臼来杀死它们。先放入碘伏中3-555分钟，再用75%酒精浸泡5分钟脱色，腹腔内注入10mL PBS缓冲液。用棉球轻轻摩擦腹部1-2分钟后，将腹腔液吸入离心管，以1000转/分钟离心。弃去上清液收集巨噬细胞，台盼蓝染色证实细胞存活率在95%以上。用RPMI-1640培养基将细胞密度调节至1.5105细胞/mL。将巨噬细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，在二氧化碳培养箱(5% 5%CO2、37)中培养3小时，然后轻轻吸去培养基，用PBS洗去未贴壁细胞，从而获得纯化的腹膜巨噬细胞

每孔培养基总体积为100L，给药组GP终浓度分别为0，10、100，200和400g/mL，而阳性对照组RPMI-1640培养基中LPS终浓度为2g/mL。所有实验组在二氧化碳培养箱(5% 5%CO2、37)中孵育所需时间，根据不同的测定方法进行不同的处理，测定各项指标。(3)巨噬细胞的吞噬能力参照王晓静法测定。将巨噬细胞的浓度调整至5105/mL，以100l/孔接种于96孔板，将5% CO2置于37培养箱中3小时，然后洗去未附着的细胞。每孔加入100L含10%小牛血清的RPMI-1640，根据培养所需剂量加入药物。培养48小时后，向每个孔中加入100 l的0.1%中性红生理盐水溶液，继续培养4小时。倾析上清液并用PBS洗涤3次。向每个孔中加入100 l细胞裂解液(冰醋酸：乙醇=1: 1 ),并在4下放置2-3小时。细胞裂解后，在酶标仪器上测量540nm处的吸光度。(4)蛋白表达诱导的肿瘤坏死因子-的检测：将100g/mL样品加入到制备好的巨噬细胞中，在5% CO2中37孵育48h，收集巨噬细胞上清液，保存于-70用于肿瘤坏死因子-活性的测定。细胞上清液中TNF-的Western blot法：以牛血清白蛋白为标准蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，样品包装保存于-70。根据每个样品的蛋白质浓度，计算样品体积，并将细胞上清液进行SDS- PAGE。然后通过电泳将凝胶上的样品转移到PDVF膜上。加入一抗羊抗TNF-，4孵育10 ~ 14小时，再加入HRP标记的二抗兔抗羊Ig-G孵育，最后采用ECL法固色，以-肌动蛋白为内参。(5)统计处理所有数据均以均数标准差(xs)表示，数据用SPSS11.0统计软件处理，检验水平为=0.05。2.体外抗氧化活性实验(1)对DPPH自由基的清除作用由于本发明产品不溶于高浓度的乙醇溶液，因此需要改进测定本发明产品对DPPH自由基清除作用的方法。改进方法如下：用95%乙醇将DPPH配成0.2mmol/L溶液。取1mL不同浓度的样品溶液、2mL新配制的DPPH乙醇溶液和2mL 95%乙醇于同一具塞试管中，混匀，避光反应30分钟，取出后于525nm处测量吸光度。空白组用2ml 95%乙醇代替DPPH溶液，对照组用2ml DPPH溶液与3ml 95%乙醇混合。每组样品一式三份，取平均值。反应体系的吸光度越低，清除DPPH自由基的能力越强。DPPH自由基清除率的计算公式为：清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac] 100%，其中Ai为样品组的吸光度值，Aj为空白组的吸光度值，Ac为对照组的吸光度值。(2)抑制-胡萝卜素-亚油酸体系氧化的实验用胡萝卜素漂白法考察了样品对-胡萝卜素-亚油酸体系氧化的抑制作用。将5毫克-胡萝卜素溶于50毫升氯仿中，加入40毫克亚油酸和400毫克三唑酮X-100，在40下旋转蒸发浓缩5分钟，除去氯仿，加入100毫升氧饱和蒸馏水，充分混合，制成乳化体系。取上述制备的乳液4.5mL，加入不同浓度的样品溶液或超纯水0.5mL，混匀，测量470nm处的吸光度作为零时的吸光度。将反应溶液在50水浴中放置2小时后，在470nm处再次测定吸光度。不含-胡萝卜素的反应液用作空白试剂，BHT用作阳性对照。样品的抗氧化率(%)根据-胡萝卜素的褪色按下式计算：A0和A0’分别为样品和空白组在零点时的吸光度；At和At’分别是反应2小时后的吸光度。3.结果和讨论(1)每个的影响

巨噬细胞参与非特异性免疫，其吞噬功能是免疫系统维持自身内环境稳定的重要手段，也是机体产生免疫反应的基础。大部分抗原经过巨噬细胞处理后，免疫原性大大增加。因此，吞噬作用是非特异性免疫的关键环节。测定小鼠巨噬细胞的吞噬能力，一般是观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用，通过计数计算吞噬百分率。本发明通过在细胞培养液中加入不同终浓度的样品来测定巨噬细胞对中性红的吞噬能力，根据测得的OD值来判断每个样品对巨噬细胞吞噬能力的影响。

四、DPPH自由基清除实验，为什么会达到最大清除率

中文名：2，2-重氮-双(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐别名：2，2'-叠氮基-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)分子式：c18h24n6o6s4分子量：548。abts氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子基团abts，可溶于水相或酸性乙醇介质，在414、645、734和815nm处有最大吸收。被测物质加入ABTS溶液后，其所含的抗氧化成分能与ABTS反应，使反应体系褪色。在abts的最大吸收波长(一般为734nm)处检测吸光度的变化，并与6-羟基-2，5，7，8的标准对照体系进行比较。四甲基苯并二氢吡喃-2单羧酸[类似VII的水溶性物质]，总抗氧化能力(teac值，即每分子抗氧化剂捕获的abt数)可以换算。

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